摘要
采用乙腈提取，QuEChERS方法净化，超高压液相色谱仪检测的方法，动态监测3种新烟碱类农药单一及混合使用后青菜中吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪的残留量变化，并进行吸附动力学分析。结果表明，青菜中3种农药的残留量随时间延长增加，不同处理组分别在24～48 h达到残留量最高值，之后残留量缓慢降低并趋于稳定。经卡方检验分析，3种农药在青菜中的吸附行为更符合准一级动力学模型，且决定系数R2大部分大于0.9。3种农药混合使用时存在相互作用，相较于农药的单独使用，混用能够提高各自在青菜中的吸附速率。吡虫啉与啶虫脒之间存在相互促进作用，混合使用后各自的残留量和峰值均提高。但两者与噻虫嗪存在抑制作用，混用后青菜中噻虫嗪的最高残留量降低。该研究为农药复合残留风险评估和田间混合施药提供了基础数据。
关键词
吡虫啉； 啶虫脒； 噻虫嗪； 残留吸附； 相互作用
中图分类号：
S 481.8
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017373
A preliminary study on residue sorption kinetics and combined effects of
three neonicotinoids in leafy vegetables
LU Yangyang1，2， GUAN Shuhui1， LI Yubo1， RAO Qinxiong1， WANG Weimin1， SONG Weiguo1
（1. Institute of AgroProduct Standards and Testing Technology， Shanghai Academy of Agricultural
Sciences， Shanghai Engineering Research Center of Agroproducts Quality and Safety， Shanghai
Service Platform of Agroproducts Quality and Safety Evaluation Technology， Shanghai 201403， China；
2.College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）
Abstract
The residues in samples were extracted with acetonitrile， cleaned up by dSPE column， and detected by ultraperformance liquid chromatography， and the pesticide adsorption kinetics were analyzed by dynamically monitoring single and mixed residues of imidacloprid， acetamiprid and thiamethoxam in Brassica chinensis. The results showed that the residues of the three pesticides adsorbed into B.chinensis increased to a maximum value at 24-48 h， then slowly declined， and finally reached a stable state. On the basis of chisquare test， the residue adsorption of three neonicotinoids in leaves conformed to the pseudofirst order kinetic model， with a determination coefficient（R2） of over 0.9.There existed interactions among the three neonicotinoids and the mixing could improve the adsorption rate of residues in B.chinensis； there was a mutual promotion between imidacloprid and acetamiprid by mixing and their residues and peak value were increased. However， imidacloprid or acetamiprid showed an inhibitory effect on thiamethoxam when mixing， and could reduce the maximum residues of thiamethoxam in B.chinensis. This study provided basic data for residue risk assessment and field application of pesticide mixtures.
Key words
imidacloprid； acetamiprid； thiamethoxam； residue sorption； mutual effect
我國是农业生产大国，也是农药使用大国，在农产品生产过程中往往会混合施用多种农药防治病虫害，致使农产品中检出多种农药残留，形成复合污染。2009年，中国绿色和平组织在北京、上海等几个城市，对常见蔬果中农药残留进行检测，结果在随机选择的45个样品中，有40个测出了50种农药残留，其中有30个样品至少存在5种以上农药残留[1]。2009-2012年对广东省中山市蔬菜中农药残留调查显示，在1种蔬菜中最多能检出5种农药残留[2]。不同农药具有不同的分子量、化学结构及官能团，它们的物理性质和化学性质有所不同，导致作物上农药的残留情况不同，因此复合污染引起的农产品质量与安全风险的不确定性值得关注[3]。某些农药混用比单剂具有更好的防治作用[4]，但混合农药如果施用不当，会对农作物产生药害[5]。阿维菌素和高效氯氰菊酯、毒死蜱联合使用对动物的毒性与各个单剂相比都有所增加[67]，甲基对硫磷和克百威混合使用对人角质形成细胞HaCaT产生协同作用[8]。相同作用机制的农药，可能产生相加、协同等复合效应，并造成累积性危害，风险可能超过单一农药残留。
有些国家已经开展机理相同的农药联合暴露的风险评估[913]。欧盟食品安全局植物保护产品和残留科学委员会评估认为复合残留的风险程度可能被低估，多种农药残留同时存在的农产品监管也缺乏相应的依据[1416]。新烟碱类杀虫剂吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪内吸性较强，活性较高，目前被120多个国家登记使用，广泛用于蔬菜、水果虫害防治[1718]。然而，我国现行的农产品中农药残留风险评估均只针对单一农药，并没有对多种农药同时存在的情形开展评估。本研究以常用的3种新烟碱类农药为靶标，通过研究其在青菜中的残留动态，分析3种农药混合污染的特征及其相互作用，为评估新烟碱类农药在食品中的累积性风险提供残留基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试对象：青菜Brassica chinensis，购于上海市农业科学院庄行试验站叶菜基地。
供试农药：97%吡虫啉原药、97%啶虫脒原药、96%噻虫嗪原药，均来自山东中农联合生物科技有限公司。
农药标准品：99.5%吡虫啉、99%啶虫脒、99%噻虫嗪，均来自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。
主要试剂：乙腈（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠（分析纯），上海凌峰化学试剂有限公司；CNW dSPE分散固相萃取纯化管（150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA，7.5 mg GCB，2mL），上海安谱实验科技股份有限公司；纯净水，上海娃哈哈饮用水有限公司；超纯水，由Millipore超纯水仪制备得到。
1.2 仪器与设备
Acquity （BSM/PDA）Waters超高压液相色谱仪（UPLC），Waters科技有限公司；JY3002电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SK8210LHC超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；EPFO945605 Talboys基本型漩涡混合器、EOFO945008 Talboys基本型多管式漩涡混合器，美国Troemner公司；D37520冷冻离心机，德国Thermo公司；5424R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；超纯水仪，美国Millipore公司；JYLC022E料理机，九阳股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 浸泡液配制及青菜处理
提前36 h配制高、中、低3种浓度的吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪的浸泡液，高浓度为500 mg/L（1.5 g原药溶于3 L纯净水）、中浓度为100 mg/L （300 mg原药溶于3 L纯净水）及低浓度为20 mg/L （60 mg原药溶于3 L纯净水），分别设置3种农药单剂处理，二元及三元农药等浓度混合，即设置以下7个处理组：吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、吡虫啉+啶虫脒、吡虫啉+噻虫嗪、啶虫脒+噻虫嗪、吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪，各做3个平行。从不同浸泡液中每隔2、6、10、14、24、36、48、60 h取等量青菜，用水冲洗青菜表面游离态农药，擦干，匀浆待测。以不加蔬菜的浸泡液和不浸泡农药的蔬菜为空白组及对照组。
1.3.2 样品前处理
稱取5 g样品于离心管中，加10 mL乙腈，涡旋30 min，加2 g NaCl，涡旋1 min，4 500 r/min离心5 min，取1 mL溶液于dSPE纯化管中，涡旋1 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，乙腈稀释到线性范围，进小瓶待上机。
1.3.3 超高压液相色谱检测方法
仪器：UPLC，检测器为PDA检测器，流动相为色谱纯乙腈（A相）和超纯水（B相），色谱柱为CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）。柱温30℃，进样量5 μL，吸附波长256 nm，流速0.4 mL/min。流动相梯度0～6.0 min，A相从5%升到30%，6.0～6.5 min，A相降到5%，6.5～8.0 min，A相保持5%。
1.3.4 标准曲线的制作及回收率的测定
用色谱纯乙腈配制0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/L的吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪的混合标准溶液，分别进样，绘制定量标准曲线。
在对照样品中添加吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪标准溶液，添加的浓度分别为0.1、10、100 mg/kg，每个添加浓度设置5个重复，完全混匀后静置2 h左右，按前述方法进行提取，并进行定量分析，计算回收率。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪的保留时间分别为4.32、4.83和3.35 min，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归曲线，测得吡虫啉在0.2～8 mg/kg范围内峰面积与浓度呈线性相关，标准曲线方程为y=14 300x+1 090，决定系数R2=0.998 1；啶虫脒的标准曲线方程为y=21 700x+746， 决定系数R2=0.997 6；噻虫嗪的标准曲线方程为y=17 400x+1 580，决定系数R2=0.999 1。
2.2 回收率的测定
吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪在青菜中的平均回收率分别为97.02%～100.17%，98.39%～101.97%，94.32%～96.10%，变异系数分别为1.35%～5.48%，1.51%～6.37%，1.68%～9.02%，均在允许范围内符合分析的标准。3种农药在青菜中的定量限均为0.1 mg/kg。
2.3 农药复合污染对吸附动力学的影响
不加蔬菜的浸泡液（空白组）中3种农药的浓度基本无变化，而不浸泡农药的蔬菜（对照组）未检出3种农药。浸泡液中吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪的最大浓度为500 mg/L，3种农药能完全溶解。所有处理中的3种农药在青菜中的残留均呈现先增加再减少的趋势。随着时间推移，青菜中的农药残留量增加，不同处理分别在24～48 h到达残留峰值，即到达吸附平衡，之后残留量缓慢降低并趋于稳定（图1）。
式中，qe1与qe2为吸附平衡时青菜中农药的含量（mg/kg），qt为时间t时青菜中农药的含量（mg/kg），k1为准一级动力学反应速率常数（1/h），k2为准二级动力学反应速率常数（kg/（mg·h））。拟合所得的相关参数如表2所示。准一级动力学模型的决定系数R2在0.863 5～0.994 4范围内，准二级动力学模型的决定系数R2在0.865 6～0.999 8范围内。
采用卡方检验法对吸附残留量实际值qt与理论预测值qe1和qe2进行分析比较，准一级动力学的卡方值为18.115，准二级动力学的卡方值为174.927，由于实际值与理论值之间的偏离程度决定卡方值的大小，且卡方值越小，预测值越符合实际值，说明青菜吸附3种农药的过程更符合准一级动力学模型。单独施药下准一级动力学的卡方值为3.680，准二级动力学的卡方值为64.164，混合施药下准一级动力学的卡方值为14.435，准二级动力学的卡方值为110.762，单独施药及混合施药下的准一级动力学的卡方值均比准二级动力学小。无论单独施药还是混合施药，青菜吸附农药的过程均更符合准一级动力学模型。
2.4 青菜中3种农药残留的相互作用
采用SPSS17.0软件分别对高、中、低3个不同浓度的残留量数据进行多因素分析，结果表明，吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪的残留量差异显著（P<0.001），表明在不同浓度浸泡液中青菜吸附单一农药残留量存在极显著差异；且在同一浓度下，单独施药与混合施药后的某一农药残留量也存在显著差异（P<0.001），表明青菜在单独及混合农药中的吸附残留量存在极显著差异。
如图1所示，20 mg/L低浓度药液处理后，青菜中吡虫啉实际残留峰值在吡虫啉、吡虫啉+啶虫脒、吡虫啉+噻虫嗪、吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪处理中分别为4.962、5.992、5.848、9.072 mg/kg，青菜中啶虫脒残留峰值在啶虫脒、吡虫啉+啶虫脒、啶虫脒+噻虫嗪、吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪处理中分别为5.230、5.552、6.536、5.848 mg/kg，青菜中噻虫嗪残留峰值在噻虫嗪、吡虫啉+噻虫嗪、啶虫脒+噻虫嗪、吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪处理中分别为5.416、3.434、3.066、3.866 mg/kg；低浓度下，混合使用后吡虫啉与啶虫脒的残留峰值均比单独使用高，但噻虫嗪混合使用的残留峰值比单独使用低。100 mg/L中浓度药液处理后，吡虫啉+啶虫脒混用处理中吡虫啉、啶虫脒的残留峰值21.293 mg/kg、23.079 mg/kg高于单独使用和其他混用处理；其他混用处理中，两者的最高残留量均受到噻虫嗪的抑制，青菜吡虫啉残留峰值在吡虫啉+噻虫嗪处理中为17.082 mg/kg，在吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪处理中为17.647 mg/kg，均低于吡虫啉单用中的19.266 mg/kg，青菜中啶虫脒残留峰值在啶虫脒+噻虫嗪处理中为21.055 mg/kg，在吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪处理中为19.173 mg/kg，均低于啶虫脒单用中的22.087 mg/kg，噻虫嗪的残留量也被吡虫啉、啶虫脒抑制，混用后青菜中噻虫嗪残留峰值（吡虫啉+噻虫嗪处理中13.988 mg/kg、啶虫脒+噻虫嗪处理中14.792 mg/kg、吡虫啉+啶虫脒+噻虫嗪处理中16.813 mg/kg）低于噻虫嗪单用（17.620 mg/kg）。较高的500 mg/L浓度药液处理后，混用后吡虫啉、啶虫脒残留峰值与20 mg/L施药浓度的趋势基本一致，与噻虫嗪相互抑制。
结果显示，高、中、低3种浓度下，吡虫啉与啶虫脒可相互提升彼此的最高残留量，但两者均可降低噻虫嗪的最高残留量。低浓度下噻虫嗪促进吡虫啉、啶虫脒最高残留量的提升，当处理浓度提高至100 mg/L后，噻虫嗪则表现出对另两种农药残留峰值的抑制作用。将残留峰值与吸附速率结合进行综合分析，3种农药二元或三元混用后吸附速率均增加，吡虫啉与啶虫脒之间相互促进，致使残留峰值也随之增加。但噻虫嗪的残留峰值却因受到吡虫啉、啶虫脒的抑制，导致吸附峰值会有所下降。
3 讨论
本文以吡虫啉、啶虫脒及噻虫嗪3种农药单独及混合浸泡的方式，对青菜中农药的残留量进行动态分析，QuEChERS法前处理，UPLCPDA检测，方法可靠。随时间延长，青菜吸附浸泡液中3种农药的量逐渐增加，于24～48 h不同时间点分别到达残留峰值，即到达吸附平衡，最后残留量缓慢降低并趋于稳定。卡方检验法分析得到青菜吸附3种农药的过程更符合准一级动力学模型。分析该模型拟合得到的平衡时吸附量及表征吸附速率的速率常数，3种农药二元或三元混合使用后吸附速率均增加，混用对单个农药吸附速率均具有促进作用。吡虫啉与啶虫脒之间的相互促进作用致使残留峰值也随之增加，但噻虫嗪的残留峰值却因受到吡虫啉、啶虫脒的抑制而有所降低。本研究针对3种新烟碱类农药的复合污染进行了初步探索，证明了相互之间存在的促进、抑制等作用。从另一方面表明，农药混用要讲究方式方法，综合考虑防治效果和安全两方面因素，如吡虫啉和啶虫脒之间具有相互促进作用，则尽量避免两者混用和轮换使用，但可选择与噻虫嗪混用。
在病虫害防治过程中，为了减少抗药性，增加防治谱，人们往往会采用混剂和轮换使用农药的方式。目前，我国指定的农药限量只考虑单一农药的风险，对产品的监管和监测也以单项指标为判定依据，并没有考虑到多种农药同时存在的相互作用问题，也没有考虑到农药同时或先后作用所产生的效应。本研究证明了3种作用机制相同农药互相之间存在促进或抑制作用，初步揭示了农药之间存在复合污染效应，并依据农药品种和剂量的不同而有所变化。COT[19]通过研究证明，人同时或先后暴露多种农药残留相对于一种农药残留来说，会引起更高或更低的联合效應；KIM等[20]报道20种化学物质可能有190多种二元联合毒性作用。李耘等[21]研究发现农药的联合毒性会随着混合物之间的浓度比例、存在的先后顺序及暴露时间等条件的不同而不同。但复合污染的机理，仍需开展更进一步的试验来揭示。李昕馨等[22]指出低剂量混合化学物更有利于建立完整、统一的混合污染毒理及风险评价体系，应从更低水平出发，依靠生物学的理论与技术，在生物组织、细胞、分子、基因水平上确定混合物之间的相互作用及剂量范围等。所以，今后的方向需要侧重的不仅仅是同类农药、同一浓度配比以及同一暴露时间，还需对多种药的多种配比及不同暴露时间等进行研究，并在细胞分子水平上进行低剂量研究，以期在未来能够确定所有农药的相互作用及相应的安全剂量，并预测联合毒性效应。
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（责任编辑：田 喆）