新疆哈族食管癌血清MicroRNA初步筛查
【摘 要】本文通过对哈萨克族食管癌血清MicroRNA初步筛查，发现其血液中特异性miRNA和确定差异性表达谱，为临床提供了一种较普遍适用、简单、低成本、灵敏、准确的早期诊断和预测食管癌预后的方法。
【关键词】食管癌；初步筛查；哈萨克族
食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，我国男女性食管癌患病率和死亡率均居世界之首位，且近年来仍呈现上升趋势。食管癌患病率因地区变化而显著不同，在我国新疆哈萨克族是食管癌的最高发民族之一，其食管癌死亡率达155.9/106，高于我国平均水平15.23/106，严重威胁着哈萨克族人民的身心健康。早期诊断不仅可以明显提高食管癌患者的生存率，而且对于提高病人的生活质量、节约卫生资源以及维护社会安定等均有重要意义。
1 研究对象
采用问卷调查、家访、医院病案资料整理分析及病理学检查等方法，对新疆内哈萨克族食管癌病人资料进行收集整理，共收集50例癌患资料，资料主要来源于当地数家医院及相关肿瘤登记机构，所有病人均经组织病理学证实。选取本实验室收集50例单发食管癌和贲门癌手术切除标本，将每例标本进行连续取材，全部石蜡包埋，每个蜡块均进行切片、HE染色，再次镜下观察、记录，筛选漏诊的双源癌，共检出112例，将所有收集到的临床资料录入Excel表，使用SPSSl3.0统计软件包进行统计学处理，检验水准采用阿尔法=0.05。
挑选50例临床资料齐全的血清标本（25例食管癌病人和25例正常），全部研究对象取清晨空腹非抗凝静脉血5mL，静置30min后，4℃1600转离心5分钟分离血清，将血清放置EP管-20℃保存待用。根据提取的miRNA量，部分样品做了技术重复以进一步消除随机误差。
2 材料与方法
2.1 主要化学试剂
表1
血清miRNA的提取一苯酚氯仿抽提体系；RT-PCR反应体系；SPSS 13.0软件；microRNA芯片分析仪。
2.2 方法
利用一苯酚氯仿抽提法抽提正常组别和对照组别的血清RNA，利用PCR技术进行扩增，microRNA芯片技术分析血清miroRNA表达谱。qRT-PCR技术检测的标准曲线的重复性，数据分析，数据分析采用SPSS 13.0软件进行数据处理。
食管癌与正常对照比较筛选的结果食管癌与正常对照比较可筛选到12个表达呈上调趋势的miRNA（fold change>1.5），这些上调表达的miRNA分别为hsa.miR.320b st、hsa.miR.320c st、hsa.miR.320a st、hsa.miR.92a st、hsa-miR-486-5p st、hsa-miR一627 st、hsa-miR.365 st、hsa.miR.1 826 st、hsa-miR-923 st、hsaomiR-l 85 st、hsa-miR.129。star st和hsa.miR.106a.star st，表达倍数1.5192.3.8319
3 讨论
食管癌目前漏诊率很高，患者5年生存率差，有效的术前诊断手段就是胃镜+活检，除了常规查体发现早期，大部分患者均是有了吞咽困难等消化道症状后才会去检查，此时肿瘤已经发展到了中晚期，错过了最佳的手术治疗时间，而早期诊断和治疗有效的降低癌的死亡率，改善生存状况。所以探索发现癌的早期诊断生物标记物，可以对对高危人群进行筛查，有助于早期发现癌。
一般来说，特异的生物标记物有三种不同的用途，首先，它能区分疾病与正常状态；其次它能用来指导预后；还能用来进行治疗或检测治疗反应。检测血中特异的miRNA作为一种生物标记物用来区分恶性肿瘤和正常有着广阔的应用前景，可以提高恶性肿瘤患者非侵入性检查的早期诊断率，改善患者的生存时间。越来越多的研究证据表明miRNA与各种恶性肿瘤的关系密切，成为肿瘤研究领域的热点之一。有文献报道miRNA可能会对癌症的诊断、预测及治疗开辟了一条新的途径；而且miRNA高表达谱与食管癌患者的低生存率有关，其中miR.129的高表达被认为在外科手术治疗的食管鳞癌患者中是一个独立而重要的预后影响因子；也有人认为miRNA在组织和血液中的表达谱在结肠癌的检测、筛查和监测中都有潜在的应用价值，而且，miRNA可能会成为结肠癌基因治疗的一个靶点；miRNA表达谱改变可以区分食管肿瘤的组织学类型、正常与癌组织，而且能鉴别出有癌变倾向的Barrett食管。miRNA广泛存在于生物体内，具有强大的调控基因表达的作用，miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻译两种作用方式调控基因的表达，而且有调节生长发育和维持机体正常生理功能等均有重要作用，正常人血浆微泡表达的miRNA能够预测血细胞的分化和代谢通路及重要的免疫调节机制，为miRNA在疾病中的预测作用奠定了基础。有研究证据都显示，miRNA可以作为一类新的肿瘤“原癌基因”或者肿瘤“抑癌基因”。若这些miRNA表达在肿瘤中升高，就被看作癌基因，它们通过促进肿瘤增殖或者抑制肿瘤抑制基因，调控肿瘤细胞的增殖和凋亡。miR.17.92是原癌miRNA的一个典型例子，它是定位于人13q31的多顺反子miRNA，这一区域的基因参与了包括恶性淋巴瘤、肺癌在内的多种肿瘤的发生。另外一些miRNA的表达在肿瘤细胞中有所降低，肿瘤抑带IJmiRNA通常通过抑制原癌基因控制细胞分化和凋亡，进一步抑制肿瘤的发展，1let.7在肺癌中的表达降低，患者的生存期缩短，这说明let.7可能是一个肿瘤抑制基因。miRNA表达谱芯片的原理简单地说就是把待测样品中的miRNA与芯片上互补的探针序列杂交，通常待测样品中miRNA的端会标记上荧光基团，杂交洗涤后扫描荧光强度，大量数据经处理后便可筛选出有显著表达差异的miRNA，这些“脱颖而出”的群体就是要瞄准的研究对象了。基因芯片高通量的特点，使得miRNA芯片非常适合检测miRNA表达谱。miRNA芯片分析可以帮助了解肿瘤组织和正常组织中miRNA表达的关系。基于此技术，一些作为原癌基因和肿瘤抑制基因的miRNA被分离鉴定出来，这将有助于理解在肿瘤发生中miRNA的作用，同时也为寻找肿瘤特异性诊断的标志物提供了依据。
我们通过昂飞的miRNA芯片杂交扫描得到的双源癌与正常对照比较的miRNA表达谱，共有12个表达上调的miRNA，与食管癌比较的miRNA表达谱也是12个上调、1个下调，与贲门癌比较的miRNA表达谱有11个上调，3组表达谱同时有8个miRNA表达上调，这8个miRNA组成的表达谱对癌的诊断有一定价值，进一步进行大范围的验证及研究其功能和相关的基因表达调节机制，将会对癌发病机制的探讨和早期诊断起到重要的作用。有研究发现在网织红细胞终末分化过程中miR.320的下调在CD71（铁传递蛋白受体）中起着重要作用，而CI）71是一个反映分化程度的标志，见于早幼红细胞、网织红细胞，成熟红细胞无表达。更进一步的调查发现miR.320在纯合子镰状细胞病的细胞中低表达和CD71在终末分化过程中的缺陷低调节有关。
我们发现癌里hsa.miR.320b st、hsa.miR.320c st、hsa.miR.320a st均有较明显的高表达，是否与CD71的调节有关还需进一步的研究。miRNA在癌症中的发生中起着重要的作用，因为超过50%的miRNA基因位于癌症相关的基因组区域，他们在各种癌症中出现错调现象，最新版本的miRBasel4.0（SangermicroRNA序列数据库）它的共收录10，581条成熟的miRNA序列信息，共涵盖115个物种，人类miRNA共721条。为了深入研究这些miRNA的功能，首先需要我们能够准确、快捷地检钡，UmiRNA在不同组织、不同发育阶段以及各种生理状态下的表达情况。当前研究miRNA表达的方法有克隆测序、RNA印迹、RT.PCR和RNA酶保护分析等，但对于肿瘤研究，需要大规模比较肿瘤组织和正常组织中的miRNA表达谱差异，以上的方法耗时耗力，检测的通量不高。在miRNA水平高通量检测基因表达的生物芯片技术在20世纪90年代发展以来，发展到今天已经非常成熟，并在基因表达检测方面得到了广泛应用。
芯片技术的应用实现了在全基因组水平鉴定成熟miRNA的表达，可于短时间内同时鉴定所有已矢NmiRNA的表达谱，成为高通量检测的最佳选择。随着计算机技术和生物信息学的发展，miRNA功能的研究更先进，可能逐一找到miRNA的靶基因，从而揭示它们的功能。
研究人员已经设计出多种miRNA靶基因预测软件，如mirBase，miRanda，targetscan，Pictar等对miRNA靶基因预测具有较高的准确性，为了减少假阳性的情况，只有推定靶基因预测至少有三个项目被接受。该基因的功能的阐释是通过基因本体Biocarta，KEGG，和GenMAPP数据库等来进行。对此，我们将在后续实验中针对筛选出来的双源癌差异表达各种miRNA，在较大的样本中采用实时定量PCR方法加以验证，结合患者的临床病理资料分析其临床意义，并在体内外实验进一步研究相关miRNA的生物学功能。
4 结论
hsa-miR·320b—st、hsa-miR-320c-st、hsa—miR·320a—st、hsa-miR一92a—st、hsa·miR-486-5p_st、hsa-miR-627-st、hsa-miR-365-st和hsa-miR-1826-st等miRNA较对照组明显上调表达，可能癌诊断标记物的探索和发病机制的探讨有一定价值。
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[责任编辑：刘帅]