材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 昆明种小鼠100只，雌雄各半，体质量（20±2）g，由深圳市疾病预防控制中心提供，购自南京君科生物工程有限公司，SPF 级条件下饲养，动物合格证号：SCXK（苏）2016-0056。
1.1.2 药物 5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，南通精华制药有限公司，批号：FA161004）：生物安全柜中操作，以无菌生理盐水稀释至2mg/ mL后EP管分装，冰箱冷藏保存。四君子合小柴胡汤：人参10g，白术15g，茯苓15g，甘草6g，柴胡25g，生半夏10g，黄芩10g，生姜10g，大枣10g。四君子汤：人参10g，白术15g，茯苓15g，甘草5g。小柴胡汤：人参10g，柴胡25g，生半夏10g，黄芩10g，生姜10g，大枣10g，甘草6g。中药生药由康美药业提供，水煎后蒸馏提取至含生药2mg/mL的水煎液，冰箱冷藏保存备用。
1.1.3 瘤株、试剂及仪器设备 肝癌H22腹水细胞，购于中国科学院深圳先进分院；RPMI-1640培养液购自北京索莱宝科技有限公司；小牛血清（FBS） 购自浙江天杭生物科技股份有限公司，流式细胞仪（FC 500 MCL/MPL，美国贝克曼库尔特公司），酶标仪（美国BioTek公司），生物安全柜（苏州净化设备公司）。
1.2 方法
1.2.1 病证模型 肝癌肝郁脾虚模型：造模分2个步骤，第1步，进行肝郁脾虚型造模，采用束缚加饮食失节法；第2步，肝郁脾虚型造模后第6天进行肝癌造模，第10天完成病证模型造模。肝郁脾虚型造模方法：采用束缚加饮食失节法，每晚将小鼠装入特制透气塑料小管中，并固定四肢和尾部限制活动，使其不能前进、后退及转身，束缚同时限制饮食，8h/d，共10d。肝癌模型造模方法：复苏冻存的腹水型肝癌 H22 细胞株，体外培养传代至对数生长期，离心，PBS 缓冲液冲洗后，生理盐水4倍稀释，充分混匀，于每只小鼠右前肢腋窝下皮下注射0.2mL。
1.2.2 分组及给药 造模后24h，将100只小鼠随机分为5组，每组20只，分别是模型组、小柴胡汤组（柴胡组），四君子汤组（四君组）、四君子合小柴胡汤组（君柴组）、5-Fu组。按组别分笼饲养，常规饮食。接种后第5天开始给药，柴胡组、四君组、君柴组、模型组4组小鼠按常规剂量分别予小柴胡汤、四君子汤、四君子合小柴胡汤、蒸馏水灌胃，1 次/d，连续给药10d；5-FU 组按照 0.1mg/10kg体重隔天1次给予 5-FU 腹腔注射，连续给药10d。
1.2.3 观测指标
1.2.3.1 荷瘤小鼠体质量和去瘤体质量 荷瘤小鼠体质量在每日给药前测定。去瘤体质量（g） = 处死前小鼠体质量（g）-解剖获得的肿瘤实际重量（g） 。
1.2.3.2 肿瘤瘤重、肿瘤指数及肿瘤生长抑制率（抑瘤率） 各组解剖所得肿瘤称重，即得肿瘤瘤重。肿瘤指数=肿瘤重量（g）/小鼠去瘤体重（g）。抑瘤率（%）=[1-实验组瘤重（g）/模型组瘤重（g）]×100%。
1.2.3.3 肿瘤细胞凋亡指数检测 将新鲜肿瘤组织1.0g左右，按常规方法制备成细胞悬液并洗涤离心106个单细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡百分比，观察细胞周期。
1.3 统计学方法
所有数据应用SPSS13.0软件进行统计学处理。所有资料以（）表示，多组间比较现采用方差分析进行显著性检验，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠体质量及去瘤体质量比较
各组显著高于模型组（P<0.05），君柴组高于5-Fu组（P<0.05）。比较小鼠去瘤体质量，各组显著高于模型组 （P<0.05），君柴组高于5-Fu组（P<0.05）。见表1。
2.2 各組小鼠肿瘤瘤重、肿瘤指数及抑瘤率比较
君柴组、5-Fu组肿瘤瘤重及肿瘤指数显著低于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05）。比较抑瘤率，5-FU 组、君柴组显著高于四君组和柴胡组（P<0.05）。见表2。
2.3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡指数比较
比较肿瘤细胞凋亡，其余4组均显著高于模型组（P<0.05），君柴组显著高于四君组和柴胡组（P<0.05）；细胞周期所占百分比比较，5-Fu组、君柴组G0-G1期细胞显著高于模型组（P<0.05）；S期细胞百分比，5-Fu组、君柴组G0-G1期细胞显著低于模型组、四君组和柴胡组（P<0.05）。见表3。
3 讨论
3.1 肝癌病机
中医学认为，原发性肝癌属“肝积”“癥瘕积聚”“臌胀”“黄疸”等范畴，肝癌多因情志抑郁，脏腑失调，气机郁滞，湿困中焦，久则脾虚食少，湿郁化热，熏蒸肝胆，气滞血瘀久而成肝积，其中以肝郁脾虚型多见[6-7]，中医学认为，肝脾两脏关系密切，脾必得肝木的条达活泼、升散疏泄之性，才能升降如常；肝气亦需脾气的滋养。肝为刚脏，必赖脾气之柔润濡养，方能不致刚强太甚而遂其条达之性。四君子汤出于《太平惠民和剂局方》，小柴胡汤出自《伤寒论》，均是中医经典名方，四君子汤可以健脾益气，小柴胡汤可以疏肝理气。四君子汤治疗气虚脾弱证，小柴胡汤治疗肝郁气滞证，临证常以两者结合加味化裁。大量研究显示中医健脾理气治疗在延长肝癌患者生存期、提高患者生存质量方面发挥了重要作用[8-9]。
3.2 研究现状
刘晓霓等[10-11]通过肝癌中医临床用药荟萃分析发现单味药用药频率第1～4位的是白术、茯苓、党参、柴胡，常用经典方有四君子汤、小柴胡汤、一贯煎、香砂六君子汤等。罗春蕾等[12]通过实验研究发现四君子汤能促进小鼠肝癌细胞凋亡，影响肿瘤细胞周期，发挥抑瘤作用。李然[13]认为少阳枢机不利是肝癌发病的重要前期因素，提出了小柴胡汤和解枢机在防治肝癌方面的重要地位。李世杰[14]发现肝癌根治术后患者用小柴胡片后，可以降低复发率。王济国等[15]研究发现肝癌肺转移应用小柴胡汤可增强化疗疗效。
综上所述，本研究着眼于四君子汤联合小柴胡汤对小鼠移植性肝癌的抑瘤作用，观察两方联合使用是否较单独使用有更好的疗效，以求为中医治疗肝癌提供更好的方药依据。本研究中，在肿瘤瘤重、肿瘤指数、抑瘤率方面，四君子合小柴胡汤组比两个方药单独使用表现更好的抑瘤效果，在肿瘤细胞凋亡方面，可见到联合使用组比两个单独使用组有更多的肿瘤细胞凋亡，差异均有统计学意义。表明四君子联合小柴胡汤使用比该两方单独使用有更好的抑瘤效果，作用机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡，值得进一步研究。
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[5] 章红燕，何福根，姜建伟，等.小柴胡汤对H22肝癌小鼠癌细胞的增殖抑制作用及其作用机制研究[J].中华中医药学刊，2014，11（6）：746-749.
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[13] 李然，刘立萍，李海波.论少阳枢机不利与肝癌的关系[J].中国中医基础医学杂志，2011，17（11）：1183-1185.
[14] 李世杰，李 潞，易成.小柴胡片对肝癌术后的预防作用的临床观察[J].成都中医药大学學报，2002，25（4）：16-18.
[15] 王济国，简文静，李阳，等.小柴胡汤对肝癌肺转移的临床观察 [J].中医临床研究，2016，8（32）：24-25.
（收稿日期：2017-01-29）