【摘要】 目的：探讨直肠癌组织中生长激素释放肽（Ghrelin）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达与淋巴结转移的关系。方法：应用免疫组织化学方法及Western blot检测Ghrelin和MMP-9在21例无淋巴结转移及35例有淋巴结转移直肠癌组织中的表达水平的表达，分析Ghrelin和MMP-9与直肠癌淋巴结转移中的关系及两者的相关性。结果：Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的阳性表达率分别为53.57%和80.36%，明显高于癌旁正常组织（P<0.05）；Ghrelin和MMP-9蛋白表达与肿瘤淋巴结转移比率联系密切，并且在直肠癌组织中的阳性表达随着淋巴结转移个数增加而增加（P<0.05）；Ghrelin与MMP-9的阳性表达呈正相关（κ=0.832，P<0.001）。结论：Ghrelin和MMP-9表达升高与直肠癌的淋巴结转移呈正相关，联合检测Ghrelin和MMP-9可能对直肠癌患者淋巴结转移及预后评估具有重要临床价值。
【关键词】 直肠癌； Ghrelin； MMP-9； 淋巴转移
作为消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，直肠癌患者的预后与肿瘤的转移密切相关[1]。淋巴转移作为直肠癌最常见的转移方式，也是影响患者预后的重要因素，目前尚未有效的预测指标对临床发生淋巴转移的高危人群进行筛选，因此，寻找新的可用于临床诊断和预后预测的分子标记，早期发现并给予早期干预，对提高直肠癌患者预后具有积极的意义。近年来的研究表明，生长激素释放肽（growth hormone releasing peptide，Ghrelin）作为一种生长激素促泌剂受体的内源性配体，可产生广泛的生物学效应，在前列腺癌、胃癌和结肠癌等多种恶性肿瘤中表达升高，并与肿瘤的侵袭和转移密切相关[2-4]。基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9，MMP-9）作为基质金属蛋白酶家族中最重要的蛋白水解酶，在调控肿瘤的侵袭和转移的过程中发挥了重要作用[5]。本研究通过检测Ghrelin和MMP-9在21例无淋巴结转移直肠癌组织及35例有淋巴结转移直肠癌组织中的表达水平，并分析其与淋巴结转移的关系，以期更好地评价直肠癌患者发生淋巴结转移的风险。
1 资料与方法
1.1 一般资料 56例直肠癌组织标本取自2010年1月-2013年1月在本院胃肠外科行手术切除的直肠癌患者，其中男31例，女25例，年龄24～81岁，中位年龄53岁。所有病例均术后经病理检查证实为直肠腺癌，患者均为首次接受肿瘤手术治疗，术前均未行放化疗。送检淋巴结12～45枚，平均（15.21±3.58）枚，淋巴结转移以术后病理检查为准，其中无淋巴结转移21例，有淋巴结转移35例。术后20 min内每份标本取材于肿瘤组织和癌旁正常黏膜组织（距肿瘤组织边缘>5 cm），迅速分成两份，分别置于-80 ℃冰箱保存和10%中性甲醛中固定备用。
1.2 淋巴结转移比率（LNR） 将肿瘤标本按淋巴结转移比率分为：LNR0（0），LNR1（<10%），LNR2（10%～25%），LNR3（>25%）。LNR=阳性淋巴结数/全部被检淋巴结数×100%。
1.3 试剂 兔抗人Ghrelin多克隆抗体购自Sigma公司，兔抗人MMP-9多克隆抗体购自Cell Signaling公司，DAB显色试剂盒和S-P试剂盒均购至北京中杉金桥生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。
1.4 免疫组化检测Ghrelin和MMP-9蛋白的表达 采用S-P法进行免疫组织化学检测，具体步骤：将直肠癌组织标本超薄切片后常规脱蜡，0.3%的H2O2去离子水孵化20 min，经抗原修复后分别加入Ghrelin（工作浓度1：50）和MMP-9（工作浓度为1∶150）在37 ℃下孵育3 h，PBS液冲洗3次；滴加生物素标记的二抗在室温下孵育30 min，PBS液冲洗3次；应用DAB显色剂显色，经充分冲洗、复染、脱水、透明和封片。并以PBS代替一抗作为阴性对照。在直肠癌组织中Ghrelin和MMP-9阳性细胞以细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。结果由2位病理科医师独立阅片判断结果。低倍镜（×100）下随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计数1000个细胞。结果判定标准为：（1）无阳性细胞为0分，阳性细胞数<25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分；（2）着色强度为淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色计3分。以（1）和（2）的乘积作为评分，≤3分为阴性，>3分为阳性。
1.5 Western blot检测Ghrelin和MMP-9蛋白的表达 直肠癌标本从-80 ℃冰箱内取出后，裂解细胞并分离细胞蛋白质，用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（20 μg/孔），常规8% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入p-AKT一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体（1∶2500）室温孵育1 h，ECL显色，条带暴光强度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）软件分析，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。
1.6 统计学处理 应用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析，对所有实验数据进行组间样本率比较用 字2检验，相关性分析应用等级资料的Spearman秩相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的表达情况 如图1所示，Ghrelin和MMP-9染色阳性细胞表现为胞核不着色，胞质染成棕褐色。在56例直肠癌中，Ghrelin和MMP-9的阳性表达率分别为53.57%和80.36%，在56例癌旁正常黏膜组织中，Ghrelin和MMP-9的阳性表达率分别为12.50%和16.07%，Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的表达率均明显高于癌旁正常黏膜组织中的表达（P<0.05）。如表1所示，与淋巴结转移阳性率低的患者相比较，淋巴结转移率高的患者中Ghrelin和MMP-9阳性表达率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。各组肿瘤组织切片均以PBS（Phosphate Buffer solution）代替特异性一抗作为空白对照组，肿瘤组织镜下均无阳性表达。
图1 Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的表达（400×）
注：有淋巴结转移（图1a、1b），无淋巴结转移（图1c、1d）
表1 Ghrelin、MMP-9蛋白在癌旁正常组织及直肠癌组织中的
表达 例
组织来源Ghrelin 字2值P值MMP-9 字2值P值
-+ -+
癌旁正常组织（n=56）4974.6240.0214799.6240.003
LNR0（n=21）147 714
LNR1（n=9）54 27
LNR2（n=17）512 215
LNR3（n=9）27 09
2.2 Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的表达 如图2所示，Western blot检测结果表明Ghrelin和MMP-9蛋白在直肠癌组织中的表达随着淋巴结转移增加而明显上调，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 直肠癌中Ghrelin与MMP-9表达的相关性分析 在56例直肠癌组织标本中，通过Spearman等级相关分析显示直肠癌组织中Ghrelin的阳性表达与和MMP-9的阳性表达呈显著正相关（κ=0.832，P<0.001），见表2。
表2 直肠癌中Ghrelin与MMP-9表达的关系 例
GhrelinMMP-9合计
-++++++
-7114426
+264214
++135211
+++11125
合计1121141056
3 讨论
直肠癌患者淋巴结转移是影响直肠癌患者根治术后生存率的最重要因素之一，侵袭和转移作为恶性肿瘤的主要生物学特性，其过程是是由多种基因调控共同作用的结果。直肠癌作为消化道最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤转移是判断患者预后和确定治疗方案的重要依据，当前仅靠单一化验指标对直肠癌患者预后进行评估的准确性不高，因此寻求一种新的生物学标志物以期早期发现及阻断直肠癌转移，从而提高患者预后成为当前直肠癌的重点研究方向。
Ghrelin是1999年由日本Kojima等发现的生长激素促泌剂受体的内源性配体，为含有28个氨基酸的活性多肽，其与受体结合后可产生广泛的生物学效应，如促进生长激素分泌、减少脂肪利用、维持能量正平衡[5]。另外，Ghrelin还可促进胃酸分泌，增加胃肠蠕动和保护心脏等[6-7]。研究表明，婴儿和胎儿有大量的Ghrelin生成细胞，但随年龄增长Ghrelin分泌细胞不断减少，从而提示Ghrelin与细胞增殖和分化有一定联系[8]。2002年，Riondino等[4]首先报道Ghrelin与肝癌细胞的恶性增殖有一定联系；在随后的研究中，更多报道表明Ghrelin在促进多种恶性肿瘤增殖中发挥了巨大作用[2-3]；另外，在对结肠癌研究中发现，Ghrelin不仅与体外恶性肿瘤细胞侵袭有巨大联系，而且与体内肿瘤分期有一定联系，从而表明Ghrelin与恶性肿瘤转移关系密切[9]。在本研究中，Ghrelin在56例直肠癌组织中的阳性表达率为53.57%，明显高于癌旁正常黏膜组织中的表达（12.50%），提示Ghrelin的表达上调与可能与直肠癌的发生相关。同时对Ghrelin的表达与直肠癌临床病理特征进行分析可知，Ghrelin表达与直肠癌的淋巴结转移程度相关；另外Ghrelin在直肠癌中的表达随着淋巴结转移增加而增加，进一步提示Ghrelin在促进直肠癌淋巴结转移中发挥了一定的作用，与文献[4]报道相符。
在肿瘤侵袭和转移的过程中，金属蛋白酶家族（MMPs）在促进肿瘤细胞侵袭、细胞外基质降解和肿瘤细胞远处转移等多种生物学行为中发挥了关键作用，Ⅳ型胶原酶（MMP-9）作为金属蛋白酶家族中最重要成员，MMP-9可降解细胞外基质和基底膜，并促进肿瘤新生血管的生成，与肿瘤浸润和转移关系密切[10-13]。同时有研究表明，恶性肿瘤侵袭和转移的能力与肿瘤细胞产生MMP-9的能力呈正相关，从而在肿瘤侵袭和转移中扮演着重要角色[14]。在本研究中，笔者采用免疫组织化学的方法检测MMP-9在直肠恶性肿瘤组织以及癌旁正常黏膜组织中的表达，结果表明，MMP-9在人直肠癌组织的阳性表达率高于癌旁正常黏膜组织中的表达，并且MMP-9在直肠癌淋巴结转移率高的患者中表达进一步上调。表明MMP-9的阳性表达与直肠癌淋巴结转移关系密切，MMP-9蛋白的表达可作为判断直肠癌淋巴结转移的参考标志物，有助于直肠癌患者预后的评价。笔者在对Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的表达进行相关性分析可知，Ghrelin的阳性表达同MMP-9的阳性表达成正相关，表明Ghrelin和MMP-9在直肠癌的发生、发展、浸润和转移过程中存在协同作用，Ghrelin和MMP-9的表达程度越高，直肠癌越容易发生淋巴结转移。
综上所述，本研究表明Ghrelin和MMP-9的阳性表达与直肠癌淋巴结转移相关，并且Ghrelin和MMP-9在直肠癌组织中的表达呈正相关，联合检测Ghrelin和MMP-9在直肠癌患者中的表达可能为肿瘤淋巴结转移提供一定有价值的临床参考，并为下一步探讨Ghrelin和MMP-9在直肠癌中的作用机制打下基础。
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（收稿日期：2014-05-28） （本文编辑：欧丽）