【摘 要】 目的：应用均匀设计方法优化小半夏加茯苓汤效用组分的配比。方法：建立H22荷瘤小鼠模型，将小鼠随机分为5组，按照均匀设计要求给予不同配比的半夏生物碱、茯苓多糖及姜辣素。连续给药10d后，次日处死。运用均匀设计方法，以瘤重为疗效指标，对数据进行处理。得到最优配比后，另增原方汤剂组、顺铂组、模型组和空白对照组各一组，将小鼠随机分为5组，连续给药10d后，次日处死。计算抑瘤率，检测对机体免疫功能的调节作用，对最优配比组方疗效进行验证。结果：由均匀设计方法得到瘤重回归方程（y=0556+006A+2091B-0271C，r=0079），其中当组方中茯苓多糖为0005mg、姜辣素为0195mg时瘤重最低。最优配比组方可反映原方汤剂的疗效，对移植瘤的生长发挥一定的抑制作用（P<001）；同时与顺铂组相比，可提高小鼠免疫器官指数及血清中TNF-α、IL-2的浓度（P<001）。结论：经过均匀设计法确定小半夏加茯苓汤的效用组分用量的优化配比，组方体现了一定的肿瘤抑制及免疫调节作用，便于对该方诱导肿瘤细胞凋亡的机制进行深入研究，有望用于肿瘤放化疗的辅助及预后治疗。
【关键词】 小半夏加茯苓汤；半夏生物碱；茯苓多糖；姜辣素；均匀设计
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0007-03
小半夏加茯苓汤是中医经典《金匮要略》中的止呕名方，临床配合西医学的化疗、放疗及药物的治疗，增强抗肿瘤的作用，减轻其他疗法的副作用，具有极大的临床实用推广价值。观察42例患者，发现小半夏加茯苓汤治疗化疗所致呕吐时在食欲减退、恶心、呕吐方面的有效率均高于甲氧氯普胺对照组，且与甲氧氯普胺有协同作用[1]。本课题组前期观察小半夏加茯苓颗粒所致家鸽呕吐次数，延长呕吐潜伏期，使每次发生呕吐的频率降低[2]。此外采用血清药理学的方法研究小半夏加茯苓颗粒抑制肝癌细胞的作用机制，发现含药血清对体外培养的肝癌SMMC-7721 细胞具有明显的抑制作用[3]。为了进一步明确小半夏加茯苓汤抗肿瘤效用组分及其配伍[4]，本研究选取半夏生物碱、姜辣素、茯苓多糖三种组分，应用均匀设计，以H22荷瘤小鼠为研究模型，选择出抑瘤效果最好的组方配比并对其疗效进行验证，为该方作用机制研究奠定基础。
1 实验材料
11 动物 昆明系小白鼠，SPF级，雌雄各半，10～12周龄，（20±2）g，购自长沙动物实验研究所，动物合格证号43006700001056。
12 细胞株 小鼠肝癌22（H22）是最常用的小鼠可移植性肿瘤细胞系之一，属于腹水型细胞株，悬浮生长，细胞活性和形态优异，广泛应用于小鼠肿瘤动物模型的复制。本实验小鼠肝癌细胞（H22）购自中国医学科学院肿瘤研究所。
13 药物 小半夏加茯苓汤由半夏18g，生姜15g，茯苓9g组成，按照传统方法水煎（1g生药/ml），中药材半夏购于贵州赫章中药材GAP生产基地，茯苓购于贵阳济仁堂有限公司，生姜市售；顺铂购于贵阳中医学院第一附属医院（生理盐水配制为1mg/ml腹腔注射液）；半夏生物碱（每克含20克原生药，批号：RLQC130517）、姜辣素（每克含20克原生药，批号：RLQC130316）、茯苓多糖（纯度为60%以上，批号：RLQC130315-3）购于西安瑞林生物科技有限公司；用于动物灌胃给药的药液由蒸馏水配置。根据先前预实验及文献[5-7]报道的有效剂量，分别制定剂量范围（表1）。按均匀设计表U5（53）及其使用表进行安排，共得5种组分配比方案，将购买到的三种组分依据方案进行配制，得到实验用药物，其具体配伍见表1。
14 仪器与试剂 CO2培养箱，Napco公司产品；倒置光学显微镜，Nikon公司产品；超净台（型号：天津泰斯特CJ-1D）；低温高速离心机（型号：长沙湘仪45171008）；分析天平；酶标仪（型号：Thermal 1510）。
15 试剂 RPMI 1640培养基（购自美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（购自杭州四季青生物工程材料公司）；小鼠IL-2（批号：EM002）、TNF-α ELISA试剂盒（批号：EM008）购自上海依科赛生物制品有限公司。
2 实验方法
21 H22荷瘤小鼠模型制备 选用的H22肿瘤瘤株属小鼠的肝细胞瘤，无菌抽取腹部接种H22瘤株7d的种鼠腹水，用无菌生理盐水调细胞浓度为1×107/ml，每只小鼠采用右腋下接种方法进行接种相应瘤细胞液01ml。
22 分组及用药
221 均匀设计优化分组及给药 将昆明系小鼠在动物实验室饲养3d后，将100只小鼠按照均匀设计要求随机分为组方一、组方二、组方三、组方四、组方五5组，每组20只。在腋下接种腹水瘤细胞液后次日开始给药。组分配比复方组以02ml/只，用蒸馏水配制为相应浓度水溶液灌胃。各组每日给药1次，连续给药10d。
222 最优配比验证分组及给药 验效试验将100只小鼠随机分为空白对照组、荷瘤模型组、顺铂组、小半夏加茯苓汤组、最优配比组方组（经均匀设计优化得到组方一为最优配比组方组）5组，每组20只。空白对照组和肿瘤模型组每天以02ml生理盐水灌胃；复方组以复方汤剂浓缩液02ml/只灌胃；顺铂组以生理盐水助溶液01ml/只腹腔注射；组分配比复方组以蒸馏水配制为相应浓度水溶液02ml/只灌胃。各组每日给药1次，连续给药10d。
23 瘤重优化组分配比 配比组方各组连续给药10d后，次日将小鼠处死，称重后剥离肿瘤，称量瘤重。
24 免疫功能调节作用检测
241 抑瘤率及免疫器官指数 验效试验各组小鼠连续给药10d后，次日取血后处死小鼠，称重后剥离肿瘤并摘取胸腺和脾脏，称瘤重、胸腺重及脾重，计算并比较各组抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数：抑瘤率（%）=[ 1 -（平均实验组瘤重/平均对照组瘤重）]×100%；胸腺指数= 胸腺质量（mg）/体重（g）；脾脏指数=脾脏质量（mg）/体重（g）。
242 外周血IL-2、TNF-α含量测定 各组小鼠末次给药次日股静脉取血，室温静置1h后离心分离血清，采用双抗体夹心ELISA法检测血清中IL-2、TNF- α的含量，严格按说明书操作，酶标仪450nm检测A值，分别建立标准曲线y=（343868-005513）/[1+（x/83180977-124922）]+005513（r2=099989），y=（1073428-014228）/[1+（x/262280092-104611）]+014228（r2=099992）。根据标准曲线测算各组IL-2、TNF-α的含量（pg/ml） 。
25 统计分析 采用SPSS 200软件处理数据，均匀设计方案所得数据用进入回归分析；验效所得数据用（x±s）表示，先进行正态性和方差齐性检验，符合条件者做方差分析。P<005表示差异有统计学意义。
3 实验结果
31 小半夏加茯苓汤效用组分的最优配比 对实验结果进行进入回归得到瘤重回归方程y=0556+006A+2091B-0271C（r=0079）。从结果可知，当B（姜辣素）=0005，C（茯苓多糖）=0195时，ymin=0514。上述实验结果表明，复方配比1的瘤重最小。
32 对小鼠H22移植瘤生长的影响 由表2 可见，与荷瘤模型组比较，复方组、顺铂组及最优配比组方的瘤重均有所降低（P<001）， 其中顺铂组的抑瘤率最高（P<001）。提示小半夏加茯苓汤及其效用组分组分配伍在肿瘤抑制方面有一定作用。
33 对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响 由表3可见，复方组、最优配比组方的免疫器官指数与小鼠血清中TNF-α、IL-2浓度明显提高，与荷瘤模型组及顺铂组比较差异有统计学意义（P<001）。而顺铂组的胸腺指数与TNF-α浓度，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<001）；IL-2浓度与之比较略有降低（P<005）。提示小半夏加茯苓汤及其效用组分配伍与顺铂相比还对免疫功能有一定的调节作用。
4 讨论
中草药质量受到气候、产地、种植工艺、炮制方法等诸多原因限制，相同药量的中药有效成分往往差异很大，造成同一方剂有效成分的稳定性不够理想，临床疗效也有较大差异[8]。中药复方的效用组分配伍是在中医药传统理论的基础之上，从临床有效药对及经典复方切入，基于相对清楚的药效物质基础与作用机理，以整体量效关系优化配比，提取中药复方的有效组分进行研究。对各效用组分进行配伍、配比两个层次的优化设计，经过药理实验验证，筛选出符合原方配伍规律及功效的较优配比[4]。
半夏的主要活性物质是生物碱，具有止呕、镇咳、祛痰、降压、降脂以及抗肿瘤作用。能激活迷走神经传出活动发挥镇吐作用，其效用物质主要是生物碱[9]。近年来国内外对半夏的研究表明其具有确切的抗肿瘤作用，采用MTT比色法、TUNEL技术与免疫组化SABC染色法，检测结果显示半夏生物碱对肝癌细胞Bel-7402增殖有显著抑制作用，可诱导Bel-7402细胞凋亡，使Bax表达显著升高而Bcl-2表达显著下降[10]；半夏多糖通过抑制PC12生长及增殖，诱导SH2SY5Y、PC12细胞凋亡达到抗肿瘤作用[11]。
姜辣素是姜生物活性的主要成分[12]，在体内外研究中采用蛋白印迹等分子生物学技术明确6-姜辣素通过抑制抗炎因子LTA5H的活性而发挥直肠癌抑瘤作用[13]。此外，姜辣素通过抑制NF-kB的活性同时减少VEGF和IL-8的分泌来调节卵巢癌细胞血管生成因子来抑制其增殖[6]。
茯苓多糖是从茯苓中提取的，为目前常用的抗肿瘤药物。不仅可以提高免疫功能，还能通过抗自由基、改变瘤体膜的生长特性、影响肿瘤细胞的信号转导及瘤体细胞蛋白和核酸的合成发挥细胞毒作用，还具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[7]。此外茯苓多糖修饰物通过增强NK细胞杀伤活力，促进淋巴细胞增殖，增强机体特异性免疫功能发挥抗肿瘤作用[14]。
本研究在前期实验基础上，选取复方中药中的主要活性组分，半夏生物碱、姜辣素及茯苓多糖，结合效用组分配伍，以瘤重为参考，通过均匀设计，优选出了最佳配比。实验结果显示效用组分组方还原了复方本来的功效，与顺铂组相比，小半夏加茯苓汤及效用组分配伍还可增强荷瘤小鼠的免疫功能。小半夏加茯苓汤是经典的止呕圣方，现代临床肿瘤的放化疗往往出现呕吐等副反应，配合使用该方可达到很好的止呕作用，通过效用组分配比对该方的作用机制的研究，发现该方还可在肿瘤抑制及免疫调节方面发挥一定作用，具体作用通路还需要进一步的实验来研究和证实。采用效用组分配伍，对阐释复方作用的物质基础提供了简便可行的研究方案，为作用机制研究提供了理论与实验依据。
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（收稿日期：20141130）