摘要 [目的]为了解牛源犬新孢子虫IMP1基因生物学特性，分析牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列。[方法]应用PCR技术扩增IMP1基因，将纯化的PCR产物和pMD18-T Simple Vector连接，构建pMD18-IMP1重组克隆质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒进行测序分析。[结果]PCR扩增犬新孢子虫IMP1基因大小为762 bp，克隆质粒经测序分析与GenBank （XM_003879531.1）中IMP1基因的同源性为99.9%。[结论]该试验为犬新孢子虫IMP1基因的表达及后续研究奠定了基础。
关键词 犬新孢子虫；IMP1基因；克隆；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）15-04566-03
Abstract [Objective] In order to understand IMP1 genitival biological characteristics， analyze cloning and sequence of bovine Neospora caninum IMP1 gene. [Method] PCR technology was applied for amplification of IMP1 genes. The products of purified PCR were connected with pMD18-T Simple Vector to construct the pMD18-IMP1 cloned plasmid， then PCR identification and enzyme digestion identification of recombinant plasmid were conducted. The positive plasmid was identified by sequencing analysis. [Result] Neospora caninum IMP1 amplified by PCR is 762 bp， the analysis of sequencing results shows that the GenBank（XM_003879531.1） IMP1 is 99% in gene homology. [Conclusion] The method laid a foundation for expression and subsequent research of Neospora caninum IMP1 gene.
Key words Neospora caninum； IMP1 gene； Clone； Sequential analysis
新孢子虫病（Neosporiasis）是由犬新孢子虫引起的多种家畜的一种原虫病，该病可引起孕畜的流产、死胎，以及新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病[1]。1988年Dubey等从瘫痪后肢的犬体分离了虫体，将其命名为犬新孢子虫[2]。犬新孢子虫为专性细胞内寄生原虫，隶属于复顶亚门原生动物门新孢子虫亚纲孢子虫纲新孢子虫属。新孢子虫病分布于世界各地，瑞士、挪威、芬兰、哥斯达黎加、爱尔兰、菲律宾、越南、泰国、以色列、俄罗斯、古巴等国都有因为新孢子虫病引发母牛流产的事件[3]。该病给畜牧业造成了巨大的经济损失，严重危害了养殖业的健康发展[4-5]。IMP1是2011年在巨型艾美耳球虫内发现的一类具有免疫保护性的蛋白，但该蛋白的来源和功能尚不明确。Cui等对犬新孢子虫IMP1基因蛋白进行了鉴定和定位的初步研究[6]。为了解牛源犬新孢子虫IMP1基因的生物学特性，笔者对IMP1基因进行克隆与序列分析，旨在为IMP1基因的表达及后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与虫株。Ecoli.DH5α菌株、犬新孢子虫吉林株和感受态，均来自延边大学预防兽医学实验室。
1.1.2 主要试剂。DNA Marker2000、pMD18-T Simple Vector、XhoⅠ、EcoRⅠ和ExTaq DNA聚合酶，购自宝生物工程公司（大连）；质粒提取试剂盒、蛋白酶K、溶菌酶和DNA凝胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；其他试剂均为国产分析纯级，市售。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计及合成。应用Primer Premier5.0及Oligo6.0软件设计了一对引物P1、P2，引物由上海英骏生物技术公司合成。（P1）上游：5′CGGGATCCATGGGAGGCGTTTGCTCTAA 3′；（P2）下游：5′CGGAATTCTTCAATGCCGGTCAGAAGC 3′。
1.2.2 IMP1基因的PCR扩增与鉴定。以犬新孢子虫吉林株基因组DNA为模板，PCR反应总体系为25 μl：2 μl dNTP，模板DNA 5 μl，上下游引物各1 μl，Taq酶0.25 μl，2.5 μl 10×PCR Buffer，ddH2O 13.25 μl。优化PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，最后72 ℃条件下延伸10 min。PCR反应结束后，将其产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 IMP1基因的克隆。用pMD18-T Simple Vector与纯化回收的IMP1片段进行连接，转入E.coli.DH5α感受态细胞，涂布于LB固体培养基上（含有Amp抗性）筛选阳性菌落。
1.2.4 重组质粒的PCR鉴定与酶切鉴定。提取重组质粒DNA，应用P1、P2进行PCR鉴定；应用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定。
1.2.5 IMP1基因片段的序列测定与分析。将鉴定正确的阳性克隆质粒送往上海英俊生物技术公司进行测序，并使用分子生物学软件 DNAstar系统对测序结果进行分析。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增 以提取的犬新孢子虫吉林株基因组DNA为模板，P1、P2为引物，扩增出片段长度为762 bp的IMP1基因片段（图1）。
2.2 重组质粒pMD18-IMP1的鉴定 将IMP1基因与pMD18-T Simple Vector质粒连接，从而获得重组克隆质粒pMD18-IMP1，进行PCR扩增，得到与目的基因片段大小一致条带，说明重组质粒中含有IMP1基因。经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，得到762 bp的目的片段和2 692 bp的载体片段（图2），说明IMP1基因成功克隆到pMD18-T Simple Vector上。
Bank （XM_003879531.1）中IMP1基因核苷酸的同源性为99.9%（图3）。而氨基酸66位编码的赖氨酸，突变之后编码甲硫氨酸，氨基酸同源性为99.6%（图4）。
3 讨论
禹海杰通过间接免疫荧光技术对弓形虫速殖子不同时期IMP1蛋白的表达特性研究发现，在游离、吸附于细胞表面、入侵中、入侵后及纳虫空泡中的速殖子IMP1均有表达，均被定位于虫体表面，且在有些虫体的顶端表达更为强烈[7]。Cui等对犬新孢子虫IMP1基因蛋白研究表明，IMP1基因蛋白编码1 182 bp的开放阅读框，编码393个氨基酸，编码的蛋白约42.9 kDa，该氨基酸序列没有信号肽和跨膜区，但有9个酰基化位点和14个磷酸化位点。试验选择IMP1开放阅读框内基因片段进行扩增与克隆，目的是为IMP1基因的表达和生物学特性的研究奠定基础。
试验对构建的IMP1基因重组质粒进行测序，得到的IMP1基因核苷酸长度为762 bp，编码243个氨基酸。核苷酸序列197位上测序为A，而NCBI中为T，与GenBank （XM_003879531.1）中IMP1基因核苷酸的同源性为99.9%；氨基酸66位编码的赖氨酸突变为甲硫氨酸，氨基酸同源性为99.6%，该突变是否对蛋白的表达及其他特性造成影响还有待于进一步研究。
参考文献
[1] BJERKAS I，MOHN S F，PRESTHUS J.Unidentified cyst-forming sporzoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs[J].Zeitschr Parasitenkunde，1984，70（2）：271-274.
[2] DUBEY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.A newly recognized fatal protozoan disease of dogs[J].J Am Vet Med Assoc，1988，192（9）：1269-1285.
[3] OOI H K，H UANG C C，YANG C H，et al.Serological survey and first finding of Neospora caninum in Tai-wan，and the detection of its antibodies in various body fluids of cattle [J].Veterinary Parasitology，2000，90：47-55.
[4] 邓冲，张维，刘群，等.乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定[J].中国兽医科学，2007，37（1）：16-19.
[5] 张守发，丁德，鞠玉琳，等.胶体金免疫层析法与ELISA法对牛的新孢子虫血清抗体检测结果的比较[J].中国兽医杂志，2008，44（8）：54-55.
[6] CUI X，LEI T，YANG D Y，et al.Identification and characterization of a novel Neospora caninum immune mapped protein 1 [J].Parasitology，2012，139（8）：998-1004.
[7] 禹海杰.弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究[D].杭州：浙江大学，2013.