摘要[目的] 分析亚东鲑线粒体COⅠ与 COⅡ基因遗传多样性。[方法] 分别从西藏亚东河与亚东鲑养殖站采集野生与养殖亚东鲑各15尾样品，对其线粒体DNA COⅠ、COⅡ基因全序列进行PCR扩增、测序比对。[结果]序列长度分别为631、634 bp。序列分析结果显示：30条亚东鲑线粒体DNA COⅠ 、COⅡ序列分别检测到1种、3种单倍型，均无碱基插入、缺失，COⅡ序列有2个位点出现碱基替换；COⅠ 、COⅡ序列T、C、A和G碱基平均含量分别为29.5%、28.97%，30.6%、28.47%，22.5%、27.03%和17.4%、15.53%，其中A+T的含量（52.0%、56.0%）均显著高于G+C含量（48.0%、44.0%），均表现出明显的碱基偏倚；COⅠ 、COⅡ单倍型多态性（h）与核苷酸多态性（π） 值分别为0、0.80与0、0.000 1；根据Kimura双参数模型构建基于线粒体COⅠ、COⅡ序列的系统进化树，两亚东鲑鱼遗传距离分别为0、0.002 4。[结论]西藏亚东鲑的遗传多样性水平较低，且养殖和野生群体无遗传分化。
关键词亚东鲑；COⅠ基因；COⅡ基因；序列特征；遗传机制；遗传分化
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07710-04
基金项目农业部公益性行业（农业）科研专项（201203086）；国家自然科学基金项目（31272633，31201760）；上海高校知识服务平台（ZF1206）。
作者简介李福贵（1987-），男，江西赣州人，博士研究生，研究方向：水产养殖学。*通讯作者。
收稿日期20140708亚东鲑（Salmo truttafraio Linne ）属鲑形目、鲑科、鲑属，又名河鲑，是分布于我国西藏地区的一种冷水性经济鱼类，原产欧洲、非洲和西亚等地区，19世纪由英国人自欧洲引种，1992年被列入西藏自治区二级重点保护水生动物[1-6]。在西藏地区已有较大规模的亚东鲑人工养殖和繁殖。随着养殖规模的扩大，亚东鲑种质资源退化现象日趋严重。目前关于亚东鲑的研究主要涉及形态学、繁殖生物学和分子生物学等方面[4-11]。
笔者测定了2个群体亚东鲑（各15尾）COⅠ、COⅡ基因序列，分别与其他几种鲑科鱼类相同基因同源序列进行比对和分析、构建进化树等，从基因水平上揭示自繁后代与野生群体的遗传变异，以期通过分析2个种群的遗传结构差异及多样性，探討外来种在长期的高原环境压力下是否会发生显著性的遗传变化、基因漂变，为合理保护和利用亚东鲑自然种质资源提供科学依据和指导，也为提高亚东鲑养殖性状、培育优良品种累积数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料所用30尾亚东鲑样品分别来源于西藏亚东河和西藏自治区亚东鲑养殖站，大西洋鲑、红点鲑、虹鳟COⅠ序列以及褐鳟、大鳞大麻哈鱼、北极红点鲑和虹鳟COⅡ序列均来自于GenBank，具体采样信息见。鱼鳍样品均用无水乙醇固定，于-20 ℃冰箱保存。
1.2 COⅠ、COⅡ引物序列用于扩增亚东鲑COⅠ、COⅡ基因片段的通用引物由上海生工（Sangon）合成，引物序列YDCOⅠ-F：5’TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC3’；YDCOⅠ-R：5’TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA3’；YDCOⅡ-F：5’ATGGCACATCCCTCACAACTAGGATT3’；YDCOⅡ-R：5’AGGCATCTTCAAGTAGGATAGTGGATCA3’。
1.3 基因组DNA提取、PCR扩增和测序试验前将鱼鳍从乙醇中取出，用蒸馏水洗净、吸水纸吸干、剪碎，按照海洋动物组织DNA抽提法（天根试剂盒）提取基因组DNA。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA的质量和浓度。稀释DNA到合适浓度用于PCR扩增。选取6组退火温度（53、54、55、56、57、58 ℃）进行梯度PCR，最终确定55、56 ℃分别为最佳退火温度。PCR反应体积为50 μl，程序为：95 ℃预变性5 min，然后35循环（95 ℃变性35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min）72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。以上反应均设置阴性对照排除DNA污染。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工完成测序。
1.4 数据处理与分析将双向测序获得的序列进行拼接，然后在GenBank数据库中进行Blast同源性搜索，经验证确定为基因序列结果。利用MEGA 4.10软件进行序列排列，同时辅以人工较对，并进行序列比较和变异检测，确定变异位点和单倍型，采用DNA SP4.10软件计算单倍型多样性（Haplotype diversity，Hd）、核苷酸多样性（Nucleotide diversity，Pi）和核苷酸歧异度（ Pairwise divergence）。用Arlequin3.01软件中的分子变异分析（AMOVA ） 方法估算遗传变异在群体间和群体内的分布，并计算群体间遗传分化系数（F-statistics，Fst） 及其显著性（重复次数1 000），群体间基因流计算公式：Nm=（1/Fst-1）/2。对测得序列碱基组成及序列间碱基替代数、差异位点进行统计分析，基于Kimura双因子参数模型构建NJ树，分析鲑科鱼类种间亲缘关系，并对所得系统树进行自展法检验1 000次重复。
2 结果与分析
2.1 COⅠ、COⅡ序列同源分析及变异位点比较PCR 扩增得到野生与自繁F1后代养殖亚东鲑30个个体清晰的COⅠ、COⅡ扩增带。经测序比对分别得到631、634 bp基因片段。与GenBank中其他鲑科鱼类mtDNA COⅠ、COⅡ序列进行Blast比对，相同基因片段的同源性分别达96%、92%以上。
种鲑科鱼类COⅡ基因片段变异位点比较30条COⅠ序列仅检测到1种单倍型，没有出现碱基的插入、缺失、替换。与大西洋鲑、红点鲑及虹鳟同源序列比对得到613 bp比对位点。35条同源序列共发现6种单倍型，其中野生和养殖亚东鲑30个体序列完全相同，共享一种单倍型。30条COⅡ序列检测到3种单倍型（野生2种，养殖1种），没有出现碱基的插入与缺失。与大西洋鲑及红点鲑COⅡ同源序列比对得到620 bp比对位点，共检测到92条（14.8%）变异位点。35条同源序列共发现8种单倍型，其中野生和养殖亚东鲑30个体序列有个别碱基差异，各有2种和1种单倍型，用ysyd1、ysyd2与yzyd表示；褐鳟2个体存在2种单倍型，用a1-2表示；大鳞大麻哈鱼1个体存在1种单倍型，用b1表示；北极红点鲑1个体存在1种单倍型，用c1表示；虹鳟1个体存在1种单倍型，用d1表示（）。
2.2 鲑科鱼类COⅠ、COⅡ碱基组成比较利用MEGA 5.05 软件分析COⅠ、COⅡ碱基组成见～3。从碱基组成的偏向性来看，G含量最低，A+T含量大于C+G含量，表现出明显的碱基偏倚，且鲑科鱼类COⅠ、COⅡ序列碱基含量特征均高度相似，这与脊椎动物线粒体DNA的特点相一致[12]。
2.3 亚东鲑种群COⅠ、COⅡ序列遗传多样性分析用MEGA5.05软件确定30个亚东鲑样本COⅠ、COⅡ序列单倍型，同时统计单倍型及多态位点（s），计算单倍型多样性（h）、平均核苷酸差异数 （k） 及核苷酸多样性（π） （）。COⅠ 没有变异位点，单倍型多态性与核苷酸多态性值均为0；COⅡ 鲑科鱼类COⅠ碱基组成的比较
种名碱基含量∥%TCAGA+TG+C野生亚东鲑29.530.622.517.452.048.0大西洋鲑31.728.722.417.254.145.9大西洋鲑31.029.222.916.953.946.1大西洋鲑31.529.022.517.054.046.0红点鲑 29.229.423.018.452.247.8虹鳟 29.629.622.618.252.247.8平均30.329.622.617.552.947.1
鲑科鱼类COⅡ碱基组成的比较
序列共检测到2个多态位点，占分析位点总数的0.3%，单倍型多态性为0.978，核苷酸多态性为0.000 1。 亚东鲑线粒体COⅠ、COⅡ序列遗传多样性参数
类群样本数亚东鲑线粒体COⅠ单倍
型数单倍型
多样性多态
位点平均核苷
酸差异数核苷酸多
样性指数亚东鲑线粒体COⅡ单倍
型数单倍型
多样性多态
位点平均核苷
酸差异数核苷酸多
样性指数养殖151000010000野生151000020.93310.066 670.000 1总体301000030.97820.066 670.000 1
2.4 鲑科鱼类COⅠ、COⅡ遗传距离及系统进化关系根据Kimura双参数模型构建基于亚东鲑鱼COⅠ序列构建的系统进化树（），得到5种鲑科鱼类遗传距离，其中野生和养殖亚东鲑共30尾序列完全相同，在进化树上位于同一位置。而与大西洋鲑、红点鲑、虹鳟遗传距离为0.03～0.06，彼此之间距离均大于种间鉴定最小遗传距离（2%）[7]。说明野生和养殖亚东鲑基本无分化。
根据COⅠ基因序列构建的NJ 系统树根据Kimura双参数模型构建基于亚东鲑鱼COⅡ序列构建的系统进化树（），得到5种鲑科鱼类遗传距离，其中亚东鲑与褐鳟遗传距离最小，均小于0.002 4；与北极红点鲑遗传距离最大，为0.054 2；亚东鲑与大鳞大马哈鱼、虹鳟遗传距离分别为0.031 2、0.039 0。结果显示，野生型和养殖型交错在一起，未表现出明显差异，说明野生和养殖亚东鲑基本无分化。
安徽农业科学2014年根据COⅡ基因序列构建的NJ 系统树3结论与讨论
3.1 线粒体 COⅠ序列同质性该研究结果显示，COⅠ基因在野生和自繁F1后代养殖亚东鲑种群之间无任何差异。这种同质性可能是由于一个相似的亚分化[13]造成的，而这种同质性产生原因可能是由2个种群内在的亲缘关系。亚东鲑鱼引入我国西藏后，在高原环境下繁衍生殖了100多年，随着人工捕捞和自然灾害的频频发生，自然选择压力之下野生种群数量势必下降。人工繁殖的亲鱼均是从河中捕捞引进，它们大多数个体是同一尾或者几尾雌鱼产生的后代。另外对野生和养殖的30尾鱼COⅠ基因测序，没有检测到不同的单倍形个体。这表明亚东鲑还没有达到在线粒体 DNA水平的较大变异。
3.2 亚东鲑COⅡ序列差异序列没有发生任何碱基的插入和缺失，A、T、C、G 4种核苷酸在线粒体基因组中的分布呈不均一性，是动物线粒体基因组的一个共性[14]。该研究所得到的亚东鲑COⅡ区中，A+T的含量（56%）显著高于G+C含量（44%），这与其他鱼类线粒体COⅡ基因序列结果类似[15]，也与邵爱华等[16]统计的15种鱼类碱基平均组成相似，表明A+T含量高可能也是鱼类mtDNA COⅡ基因碱基组成中普遍存在的现象。在DNA进化过程中，碱基转换（TS）发生的频率高于颠换（TV），该研究结果与此相符。
该试验样本来自于西藏自治区亚东鲑养殖站，其亲本来源于亚东河，系多代养殖品种。扩增的30尾亚东鲑COⅡ序列几乎完全相同，只有2个位点出现碱基变异，这可能与其长期近亲繁殖导致种质资源退化遗传多样性降低有关。
3.3 亚东鲑群体COⅠ、COⅡ的遗传多样性水平 核苷酸多态性（Pi）和单倍型平均遗传距离（P）是衡量一个种群mtDNA遗传变异的2个重要指标。其中Pi考虑了各种mtDNA单倍型在群体中所占的比例，所以在反映一个群体的mtDNA多态程度时往往比单纯的遗传距离平均值更精确[17]。该研究结果显示，基于线粒体COⅠ基因片段亚东鲑群体均具有较低的核苷酸多样性（Pi<0.005） 和较低的单倍型多样性（Hd<0.8），而基于线粒体COⅡ基因片段，亚东鲑群体均具有较低的核苷酸多样性（Pi<0.005） 和较高的单倍型多样性（Hd >0.8），因此笔者分析得出亚东鲑养殖群体和自繁F1后代野生群体均具有较低的遗传多样性水平，这与其他物种养殖群体较低的遗传多样性结果一致，说明该研究中的亚东鲑受人工养殖环境的及近亲繁殖等影响，养殖过程中出现轻微衰退，同时也预示着保护亚东鲑遗传多样性工作的重要性。
进行物种间鉴定的重要标志是种内和种间遗传距离的大小，较大的种间差异是对物种进行准确鉴定的先决条件。加拿大动物学家推荐物种鉴定最小种间遗传距离为2%，COⅠ序列系统进化树显示，野生和自繁F1后代养殖亚东鲑共30尾序列完全相同，遗传距离相同，在进化树上位于同一位置，而与大西洋鲑、红点鲑、虹鳟遗传距离为0.03～0.06，彼此之间距离均大于种间鉴定最小遗传距离（2%）[7]。说明野生和养殖亚东鲑基本无分化。COⅡ序列系统进化树显示，褐鳟与亚东鲑鱼间遗传距离均小于0.002 4，说明褐鳟即棕鳟、亚东鲑是其亚种；而亚东鲑与大鳞大麻哈鱼、虹鳟、北极红点鲑鱼间遗传距离为0.029 4～0.054 2，大于2%这一临界值，表明利用COⅡ基因序列片断可以有效地进行这几种鲑科鱼类物种的鉴定。
综上，该研究中的亚东鲑养殖群体和野生群体均具有较低的遗传多样性，因此，笔者建议种苗繁育场在进行人工繁殖时，尽量采用多种来源及遗传距离较远的不同亲鱼群体进行繁殖，避免近交衰退带来的风险，从而有利于丰富亚东鲑苗种的遗传多样性。
参考文献
[1] MACCRIMMON H R，MARSHALL T L，GOTOS B L.World distribution of brown trout，Salmo trutta：further observations[J].Journal of the Fisheries Research Board of Canada，1970，27：811-818.
[2] NELSON J S.Fishes of the world[M].3rd Edition.New York：John Wiley&Sos，1994：91-105.
[3] 西藏自治区水产局.西藏鱼类及其资源[M].北京：中国农业出版社，1995：48-49.
[4] 张春霖，王文滨.西藏鱼类初篇[J].动物学报，1962，14（4）：529-536.
[5] 武云飞，吴翠珍.青藏高原鱼类[M].成都：四川科学出版社，1991：23-25.
[6] 彭仕盛.西藏鱼类及其资源[M].北京：中国农业出版社，1995：32-33.
[7] 蒲德永，王志坚，赵海鹏，等.亚东鲑消化系统的形态学和组织学观察[J].四川动物，2006，25（4）：825-828.
[8] 豪富华，陈毅峰，唐卫星，等.亚东鲑的年龄与生长的研究[J].水生生物学报，2007，31（5）：731-737.
[9] 豪富华，陈毅峰，蔡斌，等.西藏亚东鲑的胚胎发育[J].水产学报，2006，30（3）：289-296.
[10] 豪富华.亚东鲑的生物学和遗传多样性研究[D].武汉：中国科学院研究生院（水生生物研究所），2006：15-102.
[11] 孟玮，杨天燕，海萨，等.基于线粒体COⅠ基因序列的亚东鲑DNA条形码研究[J].水产学杂志，2010，23（1）：78-79.
[12] 肖武汉，张亚平.鱼类线粒体DNA的遗传与进化[J].水生生物学报，2000，24（4）：384-391.
[13] BERNATCHEZ L，GUYOMARD R，BONHOMME F.DNA sequence variation of the mitochondrial control region among geographically and morphologically remote European brown trout Saltno trutta populations[J].Molecular Ecology，1992，1（3）：161-173.
[14] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F.The clustal X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool[J].Nucleic Acids Research，1997，25：4876-4882.
[15] 张际峰，郝培应，聂刘旺，等.2种银鱼线粒体COⅡ及侧翼tRNA基因的测定分析及其亲缘关系研究[J].中国海洋大学学报，2008，38（3）：424-428.
[16] 邵爱华，朱江，陈葵，等.暗纹东方鲀线粒体COⅠ及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析[J].遗传，2006，28（8）：963-971.
[17] ZHOU H，LI D Q，ZHANG Y G.Study on mitochondrial DNA genetic diversity of Tibetan antelope[J].Yi Chuan，2006，28（3）：299-305.